LC-MSMS法快速测定中成药,保健食品中非法添加的36种化学成分[J]

2023年8月3日发(作者：)

药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1527—LC-MS/MS法快速测定中成药、保健食品中非法添加的36种化学成分李丹,文红梅,崔福春,黄亚,郭春,孙夏荣,杨婧平(1.南京市药品检验所南京210015;2.南京中医药大学南京210029)摘要 目的:建立中成药、保健食品中非法添加的36种解热镇痛、抗炎化学成分的快速测定方法。方法:采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),以SunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm)为分析柱,流动相采用甲醇-0.1%甲酸(75∶25),电喷雾电离(ESI)、多反应监测(MRM)扫描方式,对中成药、保健食品中非法添加的36种化学成分进行快速定性定量分析。结果:建立了快速分离检测中成药、保健食品中36种非法添加成分的测定方法,检测限低于20ng。结论:该方法专属性强、灵敏度高,适用于解热镇痛、抗炎类中成药、保健品中非法添加成分的定性定量分析。关键词:液质联用色谱;多反应监测;化学成分;快速测定中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2010)08-1527-061211112LC-MS/MSscreeningfor36chemicalcomponentsinhealthfoodandChinesetraditionalpatentmedicine1211*1LIDan,WENHong-mei,CUIFu-chun,HUANGYa,GUOChun,SUNXia-rong,YANGJing-ping12(gInstituteforDrugControl,Nanjing210015,China;gUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China)Abstract Objective:Toestablishaliquidchromatography-tandemmasschromatography(LC-MS/MS)methodforthesimultaneousscreening36chs:Thismethodinvolvesliquidchromatography-tandemmassspectrometry,theseparationwasconductedbySunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm).Themobilephaseconsistedof0.1%formicandmethanol(25∶75).ThetargetcompoundswereanalyzedwithLC-MS/le-reactionmonitoring(MRM)wasusedtoscreen36chs:Afastandsensi-tiveliquidchromatographymassspectrometric(LC/MS)methsion:Themethodwassufficientlyselectiveandsensitivetodetectchds: LC-MS/MS,multiple-reactionmonitoring(MRM),chemicalComponents,rapiddetermination 近年来,随着生活水平的提高,人们越来越重视自身的健康,以网售、邮售等各种销售形式出现的中成药、保健食品也越来越多。其中,不法分子为了突显产品疗效,在中成药、保健食品中非法添加化学成分的现象非常普遍。但由于保健食品、中成药的化学成分极其复杂,现有的检验标准及方法相对滞后,这都使药检部门对非法添加化学成分的检测有一定的难度。在解热镇痛抗炎类中成药检测中,国家药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件(编号2006006)仅对双氯芬酸、氨基比林2个*南京市2008公共安全类科技发展计划项目(项目编号200801069)第一作者 Tel:;E-mail:lidaning@非法添加成分进行检测,并且采用了两种色谱体系,实验操作比较烦琐,文献报道的方法筛选品种也少[1]。本实验运用液质联用技术[3,4][2],采用多反应监测扫描方式,建立了同时检测36种解热镇痛抗炎化学成分的快速检验方法,为更好打击不法行为提供可靠的技术保障。1 仪器与试药1.1 仪器 1200LLC-MS液质联用仪(美国瓦里安公司):配有自动进样器,电喷雾接口(ESI),三重四极杆质量分析器,MsworkstationVersion6.6化学—1528—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)工作站;SartoriusBP211D电子天平(美国Sartorius公司)。1.2 试药对照品:双氯芬酸钠(10034-200302),吲哚美辛(2058-9501),萘普生(10198-002),美洛昔康(100679-200401),布洛芬(100179-200303),金诺芬(100272-199701),非普拉宗(100487-200301),酮洛芬(10337-0001),芬布芬(100415-200301),依托度酸(100667-200401),舒林酸(100335-200001),美索巴莫(100428-200401),氯唑沙宗(100364-200301),苯丙氨酯(100145-199501),尼美舒利(100555-200501),奥沙普秦(100353-200301),甲芬那酸(100190-200402),吡罗昔康(100177-199802),氨基比林(100503-200301),水杨酸(0106-9702),阿司匹林(0113-0101),安乃近(0002-9504),对乙酰氨基酚(100018-200408),安替比林(100506-200301),异丙安替比林(100525-200301),贝诺酯(0225-9601),非那西丁(100095-198904),乙水杨胺(100394-200401),赖氨匹林(100527-200401),豆腐果素(100385-200401),牛磺酸(111616-200301),罗通定(100452-200301),草乌甲素(100530-200501),高乌甲素(100547-200401),苯(100312-200001),苯溴马隆(100677-200401)均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯,甲酸为分析纯,水为重蒸水。样品:风湿散胶囊为南京市药品监督管理局查获的网络销售药品。风湿定胶囊(江西新赣江药业有限公司批号:20081001)为空白样品。2 实验方法2.1 溶液的配制对照品储备液:取上述对照品约10mg,精密称定,分别置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得各对照品储备溶液。混合对照品溶液:根据每种化合物在仪器上的相应灵敏度,各取上述对照品储备液适量置于50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。2.2 样品处理 取供试品研细,精密称取适量(约相当于1次用量),置50mL量瓶中,加流动相适量,超声处理15min,溶解,放冷置室温,加流动相稀释至刻度,取上清液加流动相稀释10倍,过0.45μm滤膜滤过即得。2.3 色谱条件 分析柱为SunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm)(Waters公司);流动相采用甲醇-0.1%甲酸(75∶25);进样量:5μL。2.4 质谱条件 电喷雾离子源(ESI);正负离子模式;多反应监测(MRM)扫描方式;喷雾针电压:5kV;雾化气压力407kPa:;干燥气温度:250℃;干燥气压力:138kPa;碰撞气压力:2mtorr;检测器电压:1.5kV;扫描间隔时间:0.5s;扫描峰宽Q1:calibra-tion;扫描峰宽Q3:calibration。2.5 样品测定 取样品溶液和混合对照品溶液各5μL注入液质联用仪,按照LC-MS/MS测定条件分别进行分析。2.6 结果判断 若供试品出现与某种对照品所有选择离子对质量数(参见表1)和保留时间均一致的色谱峰,且其峰高比与对照品一致,则确认供试品中添加的成分。3 结果与讨论3.1 质谱条件的优化 分别将36种对照品储备溶液(200μg·mL-1)用甲醇稀释成1μg·mL-1的对照溶液,选用ESI离子化模式,通过直接进样法,进行质谱条件优化,得到各化学成分的最佳毛细管电压(DP),各子离子及其相应的最佳碰撞能量(CE)[4]。多反应监测(MRM)扫描方式即采用多通道对各化学成分的检测离子在其最佳毛细管电压和碰撞能量的条件下同时进行扫描。各化合物优化结果见表1。3.2 色谱条件的优化流动相:考察了甲醇-水、甲醇-10mmol醋酸铵、甲醇-0.1%甲酸,相比较发现:甲醇-0.1%甲酸(75∶25)大多数化合物有更高的灵敏度,且保留时间比甲醇-水更稳定。色谱柱:考察过内径为2.0mm,粒径5μm,不同长度的C18柱,结果是10～15cm的色谱柱能使大部分化合物有适中的保留。3.3 方法学考察 对照品储备液逐步稀释后,按上述液质联用条件测定,以S/N=3,计算各化学成分的检测限。取混合对照品溶液,连续进样5次,计算LC/MS图谱中保留时间的相对标准偏差和峰面积相对标准偏差,以评价精密度RSD%。用流动相配制一系列不同浓度的混合标准溶液,各取5μL,按上述液质联用条件进样分析,平行测定2次,以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归,得n组成分的回归方程和相关系数。取风湿定胶囊1次用量的内容物6份,分别加入一定量对照品,按样品处理方法同法处理测定回收率。测定结果见表2。药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1529—表1 36种解热镇痛、抗炎类化学成分的质谱条件优化结果Tab1 Resultof36chemicalcomponentsatMSoptimization化学成分定性离子对CEDP(V)t(compound)(qualitativeion)(eV)R/min双氯芬酸钠(diclofenac54296/214286.267sodium)296/25010296/2785296/17945*296/25012吲哚美辛(indometacin)65358/139166.151358/17410萘普生(naproxen)40231/185103.391231/17024231/14145231/15330美洛昔康(meloxicam)70352/115144.336352/14118布洛芬(ibuprofen)55207/16186.725207/10518207/11920金诺芬(auranofin)15679/16919.52.257679/49912.5679/10926679/21531.5非普拉宗(feprazone)50321/265114.380321/2539.5321/21119321/13221酮洛芬(ketoprofen)65255/2099.52.990255/10517.5255/7737.5255/19419芬布芬(fenbufen)30255/2377.53.415255/18121.5255/15240.5255/20916依托度酸*(etodolac)90286/242156.065286/21123.5舒林酸(sulinclac)110357/23327.52.681357/34016357/24831.5357/24723美索巴莫(methocarbamol)55264/11881.713264/1995264/16310氯唑沙宗*(chlorzoxazone)65168/132202.438168/7628苯丙氨酯(phenprobamate)35180/919.52.404180/1195180/1375尼美舒利*(nimesulide)65307/229152.865307/22719.5307/19828307/7921.5奥沙普秦(oxaprozin)75294/103244.871294/27612.5294/23416.5294/20618.5甲芬那酸(mefenamicacid)35242/22410.510.377242/20925242/18039.5吡罗昔康(piroxicam)70332/95162.724续表1化学成分定性离子对CEDP(V)t(compound)(qualitativeion)(eV)R/min332/12118氨基比林(aminophenazone)55232/1139.51.466232/11111.5232/9814.5232/7019水杨酸*(salicylicacid)40137/93163.960137/6528137/7530阿司匹林*(aspirin)40179/1375.01.946179/9320安乃近(metamizolesodium)30310/1911211.149310/17522.5310/17617.5310/8026对乙酰氨基酚(paracetamol)55152/110121.574152/9320.5152/6528安替比林(phenazone)70189/77331.643189/13116189/14715.5189/10421异丙安替比林70231/18915.52.316(propyphenazone)231/20119231/14620.5贝诺酯(benorilate)30314/27252.141314/12113314/15216.5314/1635非那西丁(phencetin)70180/110182.001180/13811.5乙水杨胺(ethenzamide)60166/14961.910166/12114166/9324166/13113.5赖氨匹林(lysine35147/84141.126acetylsalicylate)147/1305豆腐果素(hilieidum)35285/12381.523285/9526牛磺酸*(taurine)70124/79181.474124/10712.5罗通定(rolundine)80356/192241.113356/16522.5草乌甲素(bulleyaconitine)120644/13545.01.115644/58428.5高乌甲素(lappaconitine)140585/162361.115585/32432585/38829苯(pizotifen)85296/96131.133296/19917苯溴马隆(benzbromarone)85425/27918.519.987425/17319425/25137.5注(note):*为负离子模式,其余为正离子模式(representnegativeion,othersarepositiveions)—1530—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)表2 36种化学成分的检测限、精密度、线性方程和回收率Tab2 LOD,precisioncalibrationcurversandrecoveryof36components成分(compound)检测限(LOD)/μg·mL-10.040.023.90.022.00.040.090.040.0080.020.080.090.20.20.0040.0040.10.090.020.080.20.50.20.050.020.20.050.020.40.50.20.0050.0040.050.040.9精密度(precision)/%tR1.400.990.900.590.880.711.391.130.980.840.671.561.251.130.990.961.060.590.650.461.701.001.951.700.811.171.381.420.823.791.591.571.573.131.670.45峰面积(area)5.876.353.072.372.903.446.634.335.232.475.564.416.028.966.483.916.523.474.711.844.322.133.952.682.286.512.934.251.301.275.932.922.427.483.456.93线性范围(linearityrange)/μg·mL-1(0.24,4.80)(0.27,10.71)(5.27,26.33)(0.50,4.94)(5.70,45.56)(0.50,4.99)(0.28,11.05)(0.24,9.44)(0.26,10.54)(0.25,9.99)(0.24,9.96)(0.27,10.58)(0.25,9.98)(0.25,9.96)(0.05,0.96)(0.24,9.73)(0.25,4.95)(0.28,10.98)(0.05,1.01)(0.26,10.28)(1.11,22.28)(2.46,24.58)(0.58,11.63)(0.06,1.22)(0.26,5.16)(1.17,23.32)(0.29,11.60)(0.50,4.96)(4.97,19.86)(1.20,23.92)(0.50,10.07)(0.67,6.66)(0.55,5.51)(0.22,5.84)(0.58,5.84)(5.79,23.16)回归方程(regressioneqution)r回收率(recovery)(n=6)/%0.99880.99790.9960.99950.99950.99790.99850.99980.99910.99940.99910.99740.99780.99900.99940.99950.99800.99820.99920.99880.99900.99980.99970.99710.99590.99910.99930.99890.99500.99700.99820.99440.99550.99430.99460.9987106.3102.8999.6102.1100.993.7102.198.1103.595.5105.289.698.5102.297.497.5101.0113.890.4109.599.798.097.0118.5109.9100.1104.696.4109.3120.182.298.898.398.097.8100.4双氯芬酸钠(diclofenacsodium)吲哚美辛(indometacin)萘普生(naproxen)美洛昔康(meloxicam)布洛芬(ibuprofen)金诺芬(auranofin)非普拉宗(feprazone)酮洛芬(ketoprofen)芬布芬(fenbufen)依托度酸(etodolac)舒林酸(sulinclac)美索巴莫(methocarbamol)氯唑沙宗(chlorzoxazone)苯丙氨酯(phenprobamate)尼美舒利(nimesulide)奥沙普秦(oxaprozin)甲芬那酸(mefenamicacid)吡罗昔康(piroxicam)氨基比林(aminophenazone)水杨酸(salicylicacid)阿司匹林(aspirin)安乃近(metamizolesodium)对乙酰氨基酚(paracetamol)安替比林(phenazone)异丙安替比林(propyphenazone)贝诺酯(benorilate)非那西丁(phencetin)乙水杨胺(ethenzamide)赖氨匹林(lysineacetylsalicylate)豆腐果素(hilieidum)牛磺酸(taurine)罗通定(rolundine)草乌甲素(bulleyaconitineA)高乌甲素(lappaconitine)苯(pizotifen)Y=1.913×107X-1.401×106Y=5.152×106X-5.259×105Y=2.178×106X-1.463×106Y=9.694×106X+2.161×106Y=2.375×106X-3.681×106Y=8.934×105X+2.386×105Y=3.981×106X-5.604×105Y=1.434×107X-2.930×105Y=5.628×106X-2.053×105Y=7.485×107X-7.481×106Y=2.9308×106X+1.367×105Y=5.729×106X+1.217×105Y=1.827×107X-1.422×105Y=2.487×106X-8.897×104Y=2.362×108X+9.398×106Y=3.381×107X-2,711×106Y=1.289×107X+6.339×105Y=9.358×106X+5.779×105Y=4.715×107X+1.449×104Y=3.077×107X+3.099×106Y=8.165×106X-2.239×106Y=9.028×106X-6.824×106Y=1.095×107X-1.326×106Y=5.652×106X+6.848×104Y=3.819×107X-1.651×105Y=1.115×107X+2.502×105Y=1.355×107X+8.896×105Y=8.560×106X+1.992×106Y=8.044×106X-2.192×107Y=4.280×105X+1.221×105Y=6.062×106X-6.440×105Y=2.042×107X+1.796×107Y=4.717×106X+2.711×106Y=1.280×106X+2.292×105Y=1.112×106X+4.481×105Y=5.498×105X-8.61×105苯溴马隆(benzbromarone)3.4 样品测定 混合对照品色谱图见图1～4,由图可见有多个组分虽然在保留时间上看似不能达到完全分离,但由于MRM方式特征母离子/子离子对具特有的专一选择性,不会造成相互间的干扰,36种化学成分均能在各通道得到较好分离。样品的色谱图见图2,保留时间1.612,6.792,3.441,6.275,药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1531—2.735min处均出现色谱峰,相应的离子对质量数152/110、207/161、231/185、294/250(-)、332/95分别与混合对照品色谱图中对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吡罗昔康保留时间及相应离子对质量数一致,由此可初步筛选出样品中可疑解热镇痛抗炎化学成分的存在。为了进一步确证样品中确认是否有此5种添加成分的存在,检测时增加相应的离子对,并将其色谱保留时间与对照品进行比较,由此判定检测样品中添加了对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吡罗昔康。用外标一点法计算(CX/AX=C1/A1)可得,样品中含对乙酰氨基酚9.51mg·粒-1,布洛芬15.93mg·粒-1,萘普生11.98mg·粒-1,双氯芬酸8.65mg·粒-1,吡罗昔康24.94mg·粒-1。图1 混合对照品多反应监测色谱图Fig1 MRMChromatogramsofmixedreference1.赖氨匹林(lysineacetylsalicylate) 2.对乙酰氨基酚(paracetamol)3.乙水杨胺(ethenzamide) 4.非那西丁(phencetin) 5.苯丙氨酯(phenprobamate) 6.安替比林(phenazone) 7.布洛芬(ibuprofen)8.异丙安替比林(propyphenazone) 9.萘普生(naproxen)3.5 讨论 多反应监测(MRM)扫描方式虽然专属性强,但建立的方法大多数被测成分色谱保留时间在5min内出峰,由于复杂基质影响,有时还是有假阳性现象产生。因此在筛选出可疑成分之后,会用多个离子对进行检查,并将峰高的比值也作为定性依据,增强了专属性,如果检测出的目标成分保留时间短或离子对少,则取单标改变流动相比例或组成进一步确认。图2 混合对照品多反应监测色谱图Fig2 MRMChromatogramsofmixedreference10.氨基比林(aminophenazone) 11.美索巴莫(methocarbamol) 12.甲芬那酸(mefenamicacid) 13.芬布芬(fenbufen) 14.酮洛芬(ke-toprofen) 15.奥沙普秦(oxaprozin) 16.苯(pizotifen) 17.贝诺酯(benorilate) 18.非普拉宗(feprazone)图3 混合对照品多反应监测色谱图Fig3 MRMChromatogramofmixedreference19.吡罗昔康(piroxicam) 20.美洛昔康(meloxicam) 21.罗通定(rolundine) 22.舒林酸(sulinclac) 23.吲哚美辛(indometacin)

24.苯溴马隆(benzbromarone) 25.高乌甲素(lappaconitine)

26.草乌甲素(bulleyaconitine) 27.金诺芬(auranofin)—1532—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)图4 混合对照品多反应监测色谱图Fig4 MRMChromatogramofmixedreference28.牛磺酸(taurine) 29.水杨酸(salicylicacid) 30.氯唑沙宗(chlorzoxazone) 31.阿司匹林(aspirin) 32.依托度酸(etodolac)

33.双氯芬酸钠(diclofenacsodium) 34.尼美舒利(nimesulide)

35.安乃近(metamizolesodium) 36.豆腐果素(hilieidum)图5 样品的多反应监测色谱图Fig5 MRMChromatogramofsample1～3.对乙酰氨基酚(paracetamol) 4～6.布洛芬(ibuprofen)

7～10.萘普生(naproxen) 使用MRM扫描方法时提高检测器电压能明显提高仪器的检测灵敏度。本方法所设检测器电压为图6 样品的多反应监测色谱图Fig6 MRMChromatogramofsample1～4.双氯芬酸钠(diclofenacsodium) 5～6.吡罗昔康(piroxicam)1.5kV,由于此条件下灵敏度已满足检测需要,所以未提高检测器电压以提高灵敏度。安乃近、对乙酰氨基酚、罗通定、草乌甲素、高乌甲素和苯用甲醇配制标样,质谱灵敏度较高,如果用流动相配制灵敏度有所下降,所以含量测定用甲醇处理样品,结果更为灵敏,准确。本实验共建立了36种解热镇痛抗炎类中成药、保健食品中非法添加成分的检测方法,该方法采用多反应监测的方式检测,干扰少,灵敏度高,检测结果更准确。参考文献1 ZHAOYan(赵艳),FUYan-min(付艳敏).DeterminationofPirox-icamAddingIllegallyinGuciXiaotongCapsulesbyHPLC(HPLC法检验骨刺消痛胶囊中非法添加西药吡罗昔康).ChinPharmAff(中国药事),2009,23(2):1592 GAOQing(高青),CHEBao-quan(车宝泉),ZHANGZhe(张喆).Identificationof16sedative-hypnoticdrugsintraditionalChi-nesemedicinesandhealthfoodsbyLC-MS/MS(LC-MS/MS法检查中药制剂及保健食品中非法添加的16种镇静催眠药物).JChinaPharmUniv(中国药科大学学报),2008,39(2):1423 LIUWei(刘伟),SHENMin(沈敏),SHENBao-hua(沈保华).Simultaneousscreeningfor22poisonousalkaloidsinbloodbyliquidchromatography-tandemmassspectrometrywithmultiple-reactionmonitoring(LC-MS/MS-MRM筛选血液中22种有毒生物碱成分).JForensicMed(法医学杂志),2007,23(5):3494 LIDan(李丹),WENHong-mei(文红梅).Screeningfor11slimchemicalcompositionsinhealthfoodbyLC-MS/MS(LC-MS/MS法快速筛选保健食品中非法添加的11种减肥化学成分).ChinPharmAff(中国药事),2009,23(4):335(本文于2009年12月5日收到)

2023年8月3日发(作者：)

药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1527—LC-MS/MS法快速测定中成药、保健食品中非法添加的36种化学成分李丹,文红梅,崔福春,黄亚,郭春,孙夏荣,杨婧平(1.南京市药品检验所南京210015;2.南京中医药大学南京210029)摘要 目的:建立中成药、保健食品中非法添加的36种解热镇痛、抗炎化学成分的快速测定方法。方法:采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),以SunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm)为分析柱,流动相采用甲醇-0.1%甲酸(75∶25),电喷雾电离(ESI)、多反应监测(MRM)扫描方式,对中成药、保健食品中非法添加的36种化学成分进行快速定性定量分析。结果:建立了快速分离检测中成药、保健食品中36种非法添加成分的测定方法,检测限低于20ng。结论:该方法专属性强、灵敏度高,适用于解热镇痛、抗炎类中成药、保健品中非法添加成分的定性定量分析。关键词:液质联用色谱;多反应监测;化学成分;快速测定中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2010)08-1527-061211112LC-MS/MSscreeningfor36chemicalcomponentsinhealthfoodandChinesetraditionalpatentmedicine1211*1LIDan,WENHong-mei,CUIFu-chun,HUANGYa,GUOChun,SUNXia-rong,YANGJing-ping12(gInstituteforDrugControl,Nanjing210015,China;gUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China)Abstract Objective:Toestablishaliquidchromatography-tandemmasschromatography(LC-MS/MS)methodforthesimultaneousscreening36chs:Thismethodinvolvesliquidchromatography-tandemmassspectrometry,theseparationwasconductedbySunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm).Themobilephaseconsistedof0.1%formicandmethanol(25∶75).ThetargetcompoundswereanalyzedwithLC-MS/le-reactionmonitoring(MRM)wasusedtoscreen36chs:Afastandsensi-tiveliquidchromatographymassspectrometric(LC/MS)methsion:Themethodwassufficientlyselectiveandsensitivetodetectchds: LC-MS/MS,multiple-reactionmonitoring(MRM),chemicalComponents,rapiddetermination 近年来,随着生活水平的提高,人们越来越重视自身的健康,以网售、邮售等各种销售形式出现的中成药、保健食品也越来越多。其中,不法分子为了突显产品疗效,在中成药、保健食品中非法添加化学成分的现象非常普遍。但由于保健食品、中成药的化学成分极其复杂,现有的检验标准及方法相对滞后,这都使药检部门对非法添加化学成分的检测有一定的难度。在解热镇痛抗炎类中成药检测中,国家药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件(编号2006006)仅对双氯芬酸、氨基比林2个*南京市2008公共安全类科技发展计划项目(项目编号200801069)第一作者 Tel:;E-mail:lidaning@非法添加成分进行检测,并且采用了两种色谱体系,实验操作比较烦琐,文献报道的方法筛选品种也少[1]。本实验运用液质联用技术[3,4][2],采用多反应监测扫描方式,建立了同时检测36种解热镇痛抗炎化学成分的快速检验方法,为更好打击不法行为提供可靠的技术保障。1 仪器与试药1.1 仪器 1200LLC-MS液质联用仪(美国瓦里安公司):配有自动进样器,电喷雾接口(ESI),三重四极杆质量分析器,MsworkstationVersion6.6化学—1528—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)工作站;SartoriusBP211D电子天平(美国Sartorius公司)。1.2 试药对照品:双氯芬酸钠(10034-200302),吲哚美辛(2058-9501),萘普生(10198-002),美洛昔康(100679-200401),布洛芬(100179-200303),金诺芬(100272-199701),非普拉宗(100487-200301),酮洛芬(10337-0001),芬布芬(100415-200301),依托度酸(100667-200401),舒林酸(100335-200001),美索巴莫(100428-200401),氯唑沙宗(100364-200301),苯丙氨酯(100145-199501),尼美舒利(100555-200501),奥沙普秦(100353-200301),甲芬那酸(100190-200402),吡罗昔康(100177-199802),氨基比林(100503-200301),水杨酸(0106-9702),阿司匹林(0113-0101),安乃近(0002-9504),对乙酰氨基酚(100018-200408),安替比林(100506-200301),异丙安替比林(100525-200301),贝诺酯(0225-9601),非那西丁(100095-198904),乙水杨胺(100394-200401),赖氨匹林(100527-200401),豆腐果素(100385-200401),牛磺酸(111616-200301),罗通定(100452-200301),草乌甲素(100530-200501),高乌甲素(100547-200401),苯(100312-200001),苯溴马隆(100677-200401)均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯,甲酸为分析纯,水为重蒸水。样品:风湿散胶囊为南京市药品监督管理局查获的网络销售药品。风湿定胶囊(江西新赣江药业有限公司批号:20081001)为空白样品。2 实验方法2.1 溶液的配制对照品储备液:取上述对照品约10mg,精密称定,分别置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得各对照品储备溶液。混合对照品溶液:根据每种化合物在仪器上的相应灵敏度,各取上述对照品储备液适量置于50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。2.2 样品处理 取供试品研细,精密称取适量(约相当于1次用量),置50mL量瓶中,加流动相适量,超声处理15min,溶解,放冷置室温,加流动相稀释至刻度,取上清液加流动相稀释10倍,过0.45μm滤膜滤过即得。2.3 色谱条件 分析柱为SunfireTMC18(2.1mm×100mm,5.0μm)(Waters公司);流动相采用甲醇-0.1%甲酸(75∶25);进样量:5μL。2.4 质谱条件 电喷雾离子源(ESI);正负离子模式;多反应监测(MRM)扫描方式;喷雾针电压:5kV;雾化气压力407kPa:;干燥气温度:250℃;干燥气压力:138kPa;碰撞气压力:2mtorr;检测器电压:1.5kV;扫描间隔时间:0.5s;扫描峰宽Q1:calibra-tion;扫描峰宽Q3:calibration。2.5 样品测定 取样品溶液和混合对照品溶液各5μL注入液质联用仪,按照LC-MS/MS测定条件分别进行分析。2.6 结果判断 若供试品出现与某种对照品所有选择离子对质量数(参见表1)和保留时间均一致的色谱峰,且其峰高比与对照品一致,则确认供试品中添加的成分。3 结果与讨论3.1 质谱条件的优化 分别将36种对照品储备溶液(200μg·mL-1)用甲醇稀释成1μg·mL-1的对照溶液,选用ESI离子化模式,通过直接进样法,进行质谱条件优化,得到各化学成分的最佳毛细管电压(DP),各子离子及其相应的最佳碰撞能量(CE)[4]。多反应监测(MRM)扫描方式即采用多通道对各化学成分的检测离子在其最佳毛细管电压和碰撞能量的条件下同时进行扫描。各化合物优化结果见表1。3.2 色谱条件的优化流动相:考察了甲醇-水、甲醇-10mmol醋酸铵、甲醇-0.1%甲酸,相比较发现:甲醇-0.1%甲酸(75∶25)大多数化合物有更高的灵敏度,且保留时间比甲醇-水更稳定。色谱柱:考察过内径为2.0mm,粒径5μm,不同长度的C18柱,结果是10～15cm的色谱柱能使大部分化合物有适中的保留。3.3 方法学考察 对照品储备液逐步稀释后,按上述液质联用条件测定,以S/N=3,计算各化学成分的检测限。取混合对照品溶液,连续进样5次,计算LC/MS图谱中保留时间的相对标准偏差和峰面积相对标准偏差,以评价精密度RSD%。用流动相配制一系列不同浓度的混合标准溶液,各取5μL,按上述液质联用条件进样分析,平行测定2次,以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归,得n组成分的回归方程和相关系数。取风湿定胶囊1次用量的内容物6份,分别加入一定量对照品,按样品处理方法同法处理测定回收率。测定结果见表2。药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1529—表1 36种解热镇痛、抗炎类化学成分的质谱条件优化结果Tab1 Resultof36chemicalcomponentsatMSoptimization化学成分定性离子对CEDP(V)t(compound)(qualitativeion)(eV)R/min双氯芬酸钠(diclofenac54296/214286.267sodium)296/25010296/2785296/17945*296/25012吲哚美辛(indometacin)65358/139166.151358/17410萘普生(naproxen)40231/185103.391231/17024231/14145231/15330美洛昔康(meloxicam)70352/115144.336352/14118布洛芬(ibuprofen)55207/16186.725207/10518207/11920金诺芬(auranofin)15679/16919.52.257679/49912.5679/10926679/21531.5非普拉宗(feprazone)50321/265114.380321/2539.5321/21119321/13221酮洛芬(ketoprofen)65255/2099.52.990255/10517.5255/7737.5255/19419芬布芬(fenbufen)30255/2377.53.415255/18121.5255/15240.5255/20916依托度酸*(etodolac)90286/242156.065286/21123.5舒林酸(sulinclac)110357/23327.52.681357/34016357/24831.5357/24723美索巴莫(methocarbamol)55264/11881.713264/1995264/16310氯唑沙宗*(chlorzoxazone)65168/132202.438168/7628苯丙氨酯(phenprobamate)35180/919.52.404180/1195180/1375尼美舒利*(nimesulide)65307/229152.865307/22719.5307/19828307/7921.5奥沙普秦(oxaprozin)75294/103244.871294/27612.5294/23416.5294/20618.5甲芬那酸(mefenamicacid)35242/22410.510.377242/20925242/18039.5吡罗昔康(piroxicam)70332/95162.724续表1化学成分定性离子对CEDP(V)t(compound)(qualitativeion)(eV)R/min332/12118氨基比林(aminophenazone)55232/1139.51.466232/11111.5232/9814.5232/7019水杨酸*(salicylicacid)40137/93163.960137/6528137/7530阿司匹林*(aspirin)40179/1375.01.946179/9320安乃近(metamizolesodium)30310/1911211.149310/17522.5310/17617.5310/8026对乙酰氨基酚(paracetamol)55152/110121.574152/9320.5152/6528安替比林(phenazone)70189/77331.643189/13116189/14715.5189/10421异丙安替比林70231/18915.52.316(propyphenazone)231/20119231/14620.5贝诺酯(benorilate)30314/27252.141314/12113314/15216.5314/1635非那西丁(phencetin)70180/110182.001180/13811.5乙水杨胺(ethenzamide)60166/14961.910166/12114166/9324166/13113.5赖氨匹林(lysine35147/84141.126acetylsalicylate)147/1305豆腐果素(hilieidum)35285/12381.523285/9526牛磺酸*(taurine)70124/79181.474124/10712.5罗通定(rolundine)80356/192241.113356/16522.5草乌甲素(bulleyaconitine)120644/13545.01.115644/58428.5高乌甲素(lappaconitine)140585/162361.115585/32432585/38829苯(pizotifen)85296/96131.133296/19917苯溴马隆(benzbromarone)85425/27918.519.987425/17319425/25137.5注(note):*为负离子模式,其余为正离子模式(representnegativeion,othersarepositiveions)—1530—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)表2 36种化学成分的检测限、精密度、线性方程和回收率Tab2 LOD,precisioncalibrationcurversandrecoveryof36components成分(compound)检测限(LOD)/μg·mL-10.040.023.90.022.00.040.090.040.0080.020.080.090.20.20.0040.0040.10.090.020.080.20.50.20.050.020.20.050.020.40.50.20.0050.0040.050.040.9精密度(precision)/%tR1.400.990.900.590.880.711.391.130.980.840.671.561.251.130.990.961.060.590.650.461.701.001.951.700.811.171.381.420.823.791.591.571.573.131.670.45峰面积(area)5.876.353.072.372.903.446.634.335.232.475.564.416.028.966.483.916.523.474.711.844.322.133.952.682.286.512.934.251.301.275.932.922.427.483.456.93线性范围(linearityrange)/μg·mL-1(0.24,4.80)(0.27,10.71)(5.27,26.33)(0.50,4.94)(5.70,45.56)(0.50,4.99)(0.28,11.05)(0.24,9.44)(0.26,10.54)(0.25,9.99)(0.24,9.96)(0.27,10.58)(0.25,9.98)(0.25,9.96)(0.05,0.96)(0.24,9.73)(0.25,4.95)(0.28,10.98)(0.05,1.01)(0.26,10.28)(1.11,22.28)(2.46,24.58)(0.58,11.63)(0.06,1.22)(0.26,5.16)(1.17,23.32)(0.29,11.60)(0.50,4.96)(4.97,19.86)(1.20,23.92)(0.50,10.07)(0.67,6.66)(0.55,5.51)(0.22,5.84)(0.58,5.84)(5.79,23.16)回归方程(regressioneqution)r回收率(recovery)(n=6)/%0.99880.99790.9960.99950.99950.99790.99850.99980.99910.99940.99910.99740.99780.99900.99940.99950.99800.99820.99920.99880.99900.99980.99970.99710.99590.99910.99930.99890.99500.99700.99820.99440.99550.99430.99460.9987106.3102.8999.6102.1100.993.7102.198.1103.595.5105.289.698.5102.297.497.5101.0113.890.4109.599.798.097.0118.5109.9100.1104.696.4109.3120.182.298.898.398.097.8100.4双氯芬酸钠(diclofenacsodium)吲哚美辛(indometacin)萘普生(naproxen)美洛昔康(meloxicam)布洛芬(ibuprofen)金诺芬(auranofin)非普拉宗(feprazone)酮洛芬(ketoprofen)芬布芬(fenbufen)依托度酸(etodolac)舒林酸(sulinclac)美索巴莫(methocarbamol)氯唑沙宗(chlorzoxazone)苯丙氨酯(phenprobamate)尼美舒利(nimesulide)奥沙普秦(oxaprozin)甲芬那酸(mefenamicacid)吡罗昔康(piroxicam)氨基比林(aminophenazone)水杨酸(salicylicacid)阿司匹林(aspirin)安乃近(metamizolesodium)对乙酰氨基酚(paracetamol)安替比林(phenazone)异丙安替比林(propyphenazone)贝诺酯(benorilate)非那西丁(phencetin)乙水杨胺(ethenzamide)赖氨匹林(lysineacetylsalicylate)豆腐果素(hilieidum)牛磺酸(taurine)罗通定(rolundine)草乌甲素(bulleyaconitineA)高乌甲素(lappaconitine)苯(pizotifen)Y=1.913×107X-1.401×106Y=5.152×106X-5.259×105Y=2.178×106X-1.463×106Y=9.694×106X+2.161×106Y=2.375×106X-3.681×106Y=8.934×105X+2.386×105Y=3.981×106X-5.604×105Y=1.434×107X-2.930×105Y=5.628×106X-2.053×105Y=7.485×107X-7.481×106Y=2.9308×106X+1.367×105Y=5.729×106X+1.217×105Y=1.827×107X-1.422×105Y=2.487×106X-8.897×104Y=2.362×108X+9.398×106Y=3.381×107X-2,711×106Y=1.289×107X+6.339×105Y=9.358×106X+5.779×105Y=4.715×107X+1.449×104Y=3.077×107X+3.099×106Y=8.165×106X-2.239×106Y=9.028×106X-6.824×106Y=1.095×107X-1.326×106Y=5.652×106X+6.848×104Y=3.819×107X-1.651×105Y=1.115×107X+2.502×105Y=1.355×107X+8.896×105Y=8.560×106X+1.992×106Y=8.044×106X-2.192×107Y=4.280×105X+1.221×105Y=6.062×106X-6.440×105Y=2.042×107X+1.796×107Y=4.717×106X+2.711×106Y=1.280×106X+2.292×105Y=1.112×106X+4.481×105Y=5.498×105X-8.61×105苯溴马隆(benzbromarone)3.4 样品测定 混合对照品色谱图见图1～4,由图可见有多个组分虽然在保留时间上看似不能达到完全分离,但由于MRM方式特征母离子/子离子对具特有的专一选择性,不会造成相互间的干扰,36种化学成分均能在各通道得到较好分离。样品的色谱图见图2,保留时间1.612,6.792,3.441,6.275,药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)—1531—2.735min处均出现色谱峰,相应的离子对质量数152/110、207/161、231/185、294/250(-)、332/95分别与混合对照品色谱图中对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吡罗昔康保留时间及相应离子对质量数一致,由此可初步筛选出样品中可疑解热镇痛抗炎化学成分的存在。为了进一步确证样品中确认是否有此5种添加成分的存在,检测时增加相应的离子对,并将其色谱保留时间与对照品进行比较,由此判定检测样品中添加了对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吡罗昔康。用外标一点法计算(CX/AX=C1/A1)可得,样品中含对乙酰氨基酚9.51mg·粒-1,布洛芬15.93mg·粒-1,萘普生11.98mg·粒-1,双氯芬酸8.65mg·粒-1,吡罗昔康24.94mg·粒-1。图1 混合对照品多反应监测色谱图Fig1 MRMChromatogramsofmixedreference1.赖氨匹林(lysineacetylsalicylate) 2.对乙酰氨基酚(paracetamol)3.乙水杨胺(ethenzamide) 4.非那西丁(phencetin) 5.苯丙氨酯(phenprobamate) 6.安替比林(phenazone) 7.布洛芬(ibuprofen)8.异丙安替比林(propyphenazone) 9.萘普生(naproxen)3.5 讨论 多反应监测(MRM)扫描方式虽然专属性强,但建立的方法大多数被测成分色谱保留时间在5min内出峰,由于复杂基质影响,有时还是有假阳性现象产生。因此在筛选出可疑成分之后,会用多个离子对进行检查,并将峰高的比值也作为定性依据,增强了专属性,如果检测出的目标成分保留时间短或离子对少,则取单标改变流动相比例或组成进一步确认。图2 混合对照品多反应监测色谱图Fig2 MRMChromatogramsofmixedreference10.氨基比林(aminophenazone) 11.美索巴莫(methocarbamol) 12.甲芬那酸(mefenamicacid) 13.芬布芬(fenbufen) 14.酮洛芬(ke-toprofen) 15.奥沙普秦(oxaprozin) 16.苯(pizotifen) 17.贝诺酯(benorilate) 18.非普拉宗(feprazone)图3 混合对照品多反应监测色谱图Fig3 MRMChromatogramofmixedreference19.吡罗昔康(piroxicam) 20.美洛昔康(meloxicam) 21.罗通定(rolundine) 22.舒林酸(sulinclac) 23.吲哚美辛(indometacin)

24.苯溴马隆(benzbromarone) 25.高乌甲素(lappaconitine)

26.草乌甲素(bulleyaconitine) 27.金诺芬(auranofin)—1532—药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(8)图4 混合对照品多反应监测色谱图Fig4 MRMChromatogramofmixedreference28.牛磺酸(taurine) 29.水杨酸(salicylicacid) 30.氯唑沙宗(chlorzoxazone) 31.阿司匹林(aspirin) 32.依托度酸(etodolac)

33.双氯芬酸钠(diclofenacsodium) 34.尼美舒利(nimesulide)

35.安乃近(metamizolesodium) 36.豆腐果素(hilieidum)图5 样品的多反应监测色谱图Fig5 MRMChromatogramofsample1～3.对乙酰氨基酚(paracetamol) 4～6.布洛芬(ibuprofen)

7～10.萘普生(naproxen) 使用MRM扫描方法时提高检测器电压能明显提高仪器的检测灵敏度。本方法所设检测器电压为图6 样品的多反应监测色谱图Fig6 MRMChromatogramofsample1～4.双氯芬酸钠(diclofenacsodium) 5～6.吡罗昔康(piroxicam)1.5kV,由于此条件下灵敏度已满足检测需要,所以未提高检测器电压以提高灵敏度。安乃近、对乙酰氨基酚、罗通定、草乌甲素、高乌甲素和苯用甲醇配制标样,质谱灵敏度较高,如果用流动相配制灵敏度有所下降,所以含量测定用甲醇处理样品,结果更为灵敏,准确。本实验共建立了36种解热镇痛抗炎类中成药、保健食品中非法添加成分的检测方法,该方法采用多反应监测的方式检测,干扰少,灵敏度高,检测结果更准确。参考文献1 ZHAOYan(赵艳),FUYan-min(付艳敏).DeterminationofPirox-icamAddingIllegallyinGuciXiaotongCapsulesbyHPLC(HPLC法检验骨刺消痛胶囊中非法添加西药吡罗昔康).ChinPharmAff(中国药事),2009,23(2):1592 GAOQing(高青),CHEBao-quan(车宝泉),ZHANGZhe(张喆).Identificationof16sedative-hypnoticdrugsintraditionalChi-nesemedicinesandhealthfoodsbyLC-MS/MS(LC-MS/MS法检查中药制剂及保健食品中非法添加的16种镇静催眠药物).JChinaPharmUniv(中国药科大学学报),2008,39(2):1423 LIUWei(刘伟),SHENMin(沈敏),SHENBao-hua(沈保华).Simultaneousscreeningfor22poisonousalkaloidsinbloodbyliquidchromatography-tandemmassspectrometrywithmultiple-reactionmonitoring(LC-MS/MS-MRM筛选血液中22种有毒生物碱成分).JForensicMed(法医学杂志),2007,23(5):3494 LIDan(李丹),WENHong-mei(文红梅).Screeningfor11slimchemicalcompositionsinhealthfoodbyLC-MS/MS(LC-MS/MS法快速筛选保健食品中非法添加的11种减肥化学成分).ChinPharmAff(中国药事),2009,23(4):335(本文于2009年12月5日收到)